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Identification prospective de l’infection congénitale au cytomégalovirus chez les nouveau-nés à l’aide de tests de réaction en chaîne de la polymérase en temps réel dans des taches de sang séchées

Le CMV est un problème de santé publique et la mise en œuvre du dépistage néonatal a été débattue. Détection de l’ADN du CMV par amplification en chaîne par polymérase PCR des taches de sang séché La DBS prélevée régulièrement pour le dépistage métabolique chez tous les nouveau-nés a Le but de cette étude était d’évaluer de façon prospective la performance des tests PCR CMV de DBS pour le dépistage néonatal CMV dans une population sélectionnée de néonatesMethods Nous avons étudié le dépistage du CMV congénitale prospective dans une population de nouveau-nés nés avec des symptômes compatibles avec CMV congénital ou nés de mères ayant des antécédents d’infection primaire pendant la grossesse Pour chaque nouveau-né, les dosages CMV PCR de DBS ont été effectués aveuglément en parallèle avec une technique de référence, à savoir CMV PCR d’un échantillon d’urine. et infection à CMV, définie par un échantillon d’urine positif dans le La première semaine de vie a été confirmée en%. Dix – neuf% des nouveau – nés infectés étaient symptomatiques et% étaient asymptomatiques. Les plages de sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive et valeur prédictive négative pour les tests PCR CMV de DBS étaient% -%; % -%; % -%, et% -%, respectivementConclusions La sensibilité et la spécificité des deux tests PCR CMV de DBS pour identifier CMV congénitale étaient très élevées dans cette population de nouveau-nés avec un risque élevé de séquelles Ces nouvelles données devraient être considérées dans le débat en cours sur la pertinence de l’utilisation de la SCP en tant qu’échantillon pour le dépistage de l’infection à CMV congénitale

Le cytomégalovirus CMV est la principale cause d’infection congénitale dans les pays industrialisés et peut expliquer jusqu’à% -% de surdité neurosensorielle chez les nourrissons et les enfants En l’absence d’un traitement établi et d’un protocole consensuel de surveillance des enfants infectés. Cependant, tant l’incidence élevée de l’infection à CMV congénitale que son importance en tant que cause de l’atteinte neurosensorielle alimentent le débat sur la justification du dépistage néonatal de l’infection par le CMV. Les principaux avantages potentiels du dépistage néonatal sont les traitements pour prévenir l’apparition ou la progression de la surdité neurosensorielle et l’identification des enfants à risque de surdité neurosensorielle tardive ou progressive CMV Polymerase Chain Reacts Les dosages PCR de DBS Tache Sanguine Séchée ont d’abord été développés pour le diagnostic rétrospectif de infection congénitale chez les enfants ayant une perte auditive ou d’autres symptômes congénitaux liés au CMV qui n’ont pas été diagnostiqués à la naissance [,,,,,,], et qui ont également été proposés pour le dépistage néonatal . Un certain nombre de protocoles ont été rapportés dans la littérature. ,,,,,], avec des sensibilités variables in vitro selon la méthode d’extraction de l’ADN utilisée In, nous avons validé les tests de CMV PCR de DBS basés sur différents protocoles d’extraction et d’amplification démontrant une bonne sensibilité in vitro L’étude a consisté à évaluer de façon prospective la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives des dosages CMV PCR de DBS pour l’identification des nouveau-nés porteurs d’une infection congénitale à CMV dans une population de nouveau-nés français à risque élevé d’infection. de l’étude sont discutés à la lumière du débat en cours sur l’utilisation de DBS comme un échantillon pour dépister l’infection congénitale à CMV

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Population étudiée

Étude prospective

Les nouveaux-nés ont été recrutés prospectivement dans les maternités des principaux centres de référence pour l’infection congénitale à CMV en région parisienne. Hôpital Necker / Institut de Puériculture, Hôpital de Poissy et Hôpital de Béclère de janvier à décembre Participation à l’étude auprès des parents de tous les nouveau-nés à un groupe à haut risque, c.-à-d. enfants présentant des symptômes cliniques compatibles avec le CMV congénital et / ou nés d’une mère ayant des antécédents d’infection primitive au CMV pendant la grossesse Des échantillons d’urine ont été prélevés pendant la première semaine de vie pour le dépistage métabolique, stocké dans des conditions standard, et récupéré des laboratoires de dépistage régionaux après l’achèvement du dépistage métabolique approbation du comité d’éthique a été obtenue autorisation – A- Tous les parents ont donné leur consentement écrit pour leurs enfants à participer à l’étude

Étude rétrospective chez des enfants nés de mères infectées par le VIH

Bien que le dépistage néonatal de l’infection CMV congénitale ne soit pas recommandé en France, il est largement pratiqué chez les enfants nés de mères infectées par le VIH Lorsque le dépistage néonatal d’un échantillon d’urine a été positif, les parents ont été invités à participer à l’étude. Les cartes Guthrie ont été récupérées auprès des laboratoires de dépistage régionaux

Méthodes de détection du CMV

La technique de référence était une PCR CMV d’un échantillon d’urine qui a été réalisée en utilisant soit un laboratoire interne de virologie PCR en temps réel des hôpitaux Necker et Poissy, comme ailleurs , soit le kit PCR CMV Abbott; Hôpital Béclère Pour la DBS, les dosages CMV PCR ont été réalisés en aveugle sur les résultats de la technique de référence et systématiquement avec des protocoles techniques et dans différents laboratoires Necker et Béclère, comme décrit ailleurs

Extraction d’ADN de DBS

En bref, un diamètre unique de DBS entier, mm, a été coupé dans des bandelettes qui ont été utilisées pour l’extraction d’ADN dans le protocole, après prétraitement avec un tampon de lyse hydroxyde de sodium,%, extraction avec le QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen, selon les instructions du fabricant, l’ADN a été élue avec un ul de tampon d’élution dans le protocole, après incubation avec un tampon de lyse Tris-HCl, mM; pH, chlorure de sodium, mM; EDTA, mM; SDS,%; la protéinase K, mg / ml, l’extraction au phénol-chloroforme et la précipitation à l’éthanol ont été réalisées. Le culot d’ADN a été mis en suspension dans des ul de tampon Tris-HCl sans DNase, mM; EDTA, protocole mMIn, tous les extraits d’ADN ont été soumis à un test interne de PCR en temps réel sur le gène albumine humaine Ceci a été fait pour vérifier la qualité de l’extraction d’ADN de chaque échantillon. densité à nm NanoDrop, Spectrophotomètre, ND-, Labtech

Amplification de l’ADN du CMV

Dans le protocole, l’amplification de l’ADN du CMV a été réalisée en utilisant une PCR interne en temps réel, comme décrit ailleurs , et tous les extraits ont été amplifiés en double. Les résultats obtenus avec ce protocole ont été analysés sous conditions: quand au moins des doublons était positif / – ou – /; condition ou lorsque les doublons ont été testés positifs /; Dans le protocole, l’ADN du CMV a été amplifié en utilisant le kit PCR CMV Abbott en une seule amplification

Analyses statistiques

La sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives ont été calculées en utilisant des méthodes standard et des limites de confiance exactes en%. Les accords entre les protocoles ont été évalués en utilisant le coefficient Kappa de Cohen. La DBS selon l’état clinique symptomatique et asymptomatique à la naissance a été comparée à l’aide du test de la somme des rangs de Wilcoxon. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel SAS, version SAS Institute.

RÉSULTATS

Population étudiée

Étude prospective

La description des nouveau-nés inclus dans l’étude est rapportée dans le tableau. Les raisons du dépistage néonatal étaient différentes chez les nouveau-nés infectés et non infectés. Le test exact de Fisher, P & lt; La plupart des nouveau-nés infectés ont été dépistés en raison d’antécédents d’infection primaire maternelle, et la raison la plus fréquente du dépistage dans l’ensemble de la population était la présence de symptômes compatibles avec le CMV.

Tableau Caractéristiques des nourrissons inclus dans l’étude prospective Caractéristique Non% des nourrissons Sexe Masculin Féminin Critères d’inclusion Symptômes de CMV seuls Antécédents d’infection primaire maternelle Les deux raisons précédentes Non précisée Nourrissons ayant une infection congénitale à CMV confirmée technique de référence Statut clinique à la naissance des nourrissons infectés Symptômes asymptomatiques symptomatiques Critères d’inclusion chez les nouveau-nés infectés Symptômes CMV seuls Antécédents d’infection primaire maternelle Les deux raisons précédentes Non spécifié Caractéristique Non% de nourrissons Sexe Masculin Féminin Critères d’inclusion Symptômes de CMV seuls Antécédents d’infection primaire maternelle Les deux raisons précédentes Non précisée Nourrissons avec CMV congénital confirmé technique de référence positive pour l’infection État clinique à la naissance des nourrissons infectés Critères d’inclusion asymptomatiques symptomatiques chez le nouveau-né infecté Symptômes compatibles CMV seul Histoire de l’infection primaire maternelle Les deux raisons précédentes non précisées Note CMV, cytomégalovirus View Large des nouveau-nés infectés,% étaient asymptomatiques et% étaient symptomatiques Symptômes inclus retard de croissance intra-utérin chez les patients le seul symptôme chez les patients, implication neurologique chez les patients, thrombocytopénie chez les patients, hépatomegalie chez les patients, ascite chez les patients et entérocolite chez les patients Deux nouveau-nés infectés ont été traités avec du ganciclovir au moment du dépistage néonatal. Des échantillons d’urine et de DBS ont été obtenus chez tous les nouveau-nés. ; pour ces nouveau-nés, la PCR CMV de DBS a été réalisée uniquement avec le protocole

Étude rétrospective

Au cours de la période d’étude, des échantillons d’urine de nouveau-nés nés de mères infectées par le VIH ont été examinés pour le CMV congénital au laboratoire de virologie Necker; de ces nouveau-nés avaient une détection positive dans l’urine%; Aucun de ces nouveau-nés n’était co-infecté par le VIH. Parmi ces nouveau-nés, la carte de Guthrie a été testée Six de ces nouveau-nés étaient asymptomatiques; l’un avait une infection sévère avec atteinte neurologique

Sensibilité et spécificité des tests de PCR CMV de la table DBS

Avec le protocole, les résultats de PCR de l’albumine étaient positifs pour tous les extraits de DBS, et la moyenne ± écart type de l’ADN génomique était de ± μg / mL Les performances des protocoles sont rapportées dans le tableau Il y avait un bon niveau d’accord entre les protocoles. % d’intervalle de confiance, – Avec le protocole, DBS des nourrissons infectés étaient CMV PCR discordant dans les doublons / – Ces DBS ont été obtenus à partir de nouveau-nés asymptomatiques Avec ce protocole, des résultats faussement positifs ont été observés dans les cas positifs positifs et dans les cas positifs seulement dupliquer

Performances des tests de réaction en chaîne de la polymérase en temps réel PCR des taches séchées DBS pour détecter une infection congénitale confirmée par cytomégalovirus CMV chez les nouveau-nés et les charges virales en protocole DBS Au moins duplicata positif / – ou – / Deux résultats positifs / Résultat test de référence Positif Négatif Total Positif Négatif Total Positif Négatif Total Positif Négatif Analyses,%% intervalle de confiance Sensibilité – – – Spécificité – – – VPP – – – VAN – – – Charge virale, médiane, log copies / mL Confirmé positif n = – n = – Faux- positif n = – n = – Au moins un doublon positif / – ou – / n = – NA Protocole Protocole Au moins un double positif / – ou – / Deux doubles positifs / Résultat du test de référence Positif Négatif Total Positif Négatif Total Positif Négatif Total Positif Négatif Analyses,%% intervalle de confiance Sensibilité – – – Spécificité – – – VPP – – – VAN – – – Charge virale, médiane, log copies / mL Confirmé positif n = – n = – Faux positif n = – n = – Au moins doublon positif / – ou – / n = – SO Note NA, non applicable; NPV, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positiveVoir le protocole LargeWith, résultats faussement négatifs de CMV PCR de DBS ont été observés Deux de ces DBS ont été obtenues chez des nouveau-nés symptomatiques présentant un retard de croissance intra-utérin isolé et un nouveau-né asymptomatique.

Résultats de la PCR CMV de la DBS des nouveau-nés nés de mères infectées par le VIH

Tous les DBS étaient positifs avec le protocole, et au moins des doublons était positif chez tous les nouveau-nés avec protocole; cependant, pour DBS, seul le positif testé en double avec ce protocole

Quantification de l’ADN du CMV dans DBS

Avec le protocole, la charge virale médiane en DBS positive était de log copies / mL gamme, – log copies / mL Tableau Les charges virales ont également été calculées comme le nombre de copies d’ADN CMV par cellules, car l’albumine PCR a permis le calcul du nombre de cellules étudiées Dans chaque puits de PCR Une fois exprimée de cette manière, la charge virale médiane de DBS positive était de log copies /, gamme de cellules, – log copies /, cellsWith protocole, la charge virale médiane de DBS positive était log copies / ml range, – log copies / mLLa corrélation entre les charges virales obtenues avec les protocoles était faible R = Les charges virales dans les DBS faussement positifs étaient faibles avec les protocoles

Charge d’ADN de CMV dans la DBS et état clinique néonatal

Les charges virales obtenues avec les deux protocoles ont été comparées entre les nouveau-nés symptomatiques et asymptomatiques. Pour cette analyse, seuls les patients dont le DBS a été testé avec les protocoles ont été analysés n = En outre, les valeurs de charge virale obtenues chez les nouveau-nés symptomatiques traités par ganciclovir intraveineux au moment du dépistage ont été exclus de cette analyse. Par conséquent, cette analyse incluait les nouveau-nés asymptomatiques et symptomatiques

Figure Vue largeDownload slideCytomegalovirus Charges d’ADN CMV dans les taches de sang séchées DBS, selon l’état clinique néonatal Les résultats ont été obtenus avec protocole et exprimés en copies journal par ml de sang Les boîtes représentent la gamme interquartile IQR, avec des barres horizontales pour les valeurs médianes et cercle complet pour les valeurs moyennes Les barres verticales représentent l’IQR; la barre horizontale supérieure est la valeur maximale dans IQR au-dessus du percentile th, et la barre horizontale inférieure est la valeur minimale dans IQR en dessous du percentile th Les carrés vides sont les valeurs maximales au-dessus IQR du percentile th ou la valeur minimale en dessous de IQR du th percentileFigure View largeTélécharger la diapositiveCytomegalovirus Charges de l’ADN CMV dans les taches de sang séché DBS, selon l’état clinique néonatal Les résultats ont été obtenus avec protocole et sont exprimés en copies journal par ml de sang Les boîtes représentent la gamme interquartile IQR, avec barres horizontales pour valeurs médianes et cercle complet pour les valeurs moyennes Les barres verticales représentent l’IQR; la barre horizontale supérieure est la valeur maximale dans IQR au-dessus du percentile th, et la barre horizontale inférieure est la valeur minimale dans IQR en dessous du percentile th Les carrés vides sont les valeurs maximales au-dessus IQR du percentile th ou la valeur minimale en dessous de IQR du th le protocole percentileWith, la charge virale médiane était de l’ordre du nombre de copies log / mL, – les copies log / mL chez les nouveau-nés asymptomatiques et les copies de journaux / gamme mL, – les copies log / mL chez les nouveau-nés symptomatiques; la différence était statistiquement significative Test de Wilcoxon, P = Lorsque les charges virales étaient normalisées avec les résultats de l’albumine PCR, la charge virale médiane chez les nouveau-nés symptomatiques était également plus élevée que chez les nouveau-nés asymptomatiques log /, cellules [gamme, – log copies /, vs log copies /, cells [range, – log copies /, cells]; P = Au contraire, avec le protocole, les charges virales médianes n’étaient pas significativement différentes P =, avec des copies de journal / gamme mL, – copies de journal / mL chez les nouveau-nés asymptomatiques et les copies de journal / gamme mL, – copies de journal / mL chez les nouveau-nés symptomatiques

Analyse de séries de la littérature

Dans le tableau, nous avons rapporté certaines caractéristiques des principales séries publiées comparant la performance des tests PCR CMV dans DBS avec celle d’une technique de référence détection CMV dans des échantillons d’urine ou de salive

Comparaison de la population totale Séroprévalence chez les femmes enceintes dans le pays ou groupe ethnique,% Critères d’inclusion Nouveau-nés avec CMV confirmé Infection Taille de DBS utilisée, diamètre total Type d’extraction Sensibilité,% Spécificité,% Barbi et al Rétrospective – Symptômes compatibles – Disques PI internes mm Choc thermique – – Soetens et al Rétrospective UN ~ Criblage universel spot mm Phénol chloroforme NA Easy MAG BioMérieux NA Atkinson et al Rétrospective NA ONU Infection à CMV confirmée Demi-point mm QiaAmp DNA Mini kit sanguin Qiagen – NA Boppana et al Prospective, & gt; Disques de dépistage universels mm Qiagen M Qiagen – Étude actuelle Prospective ~ -Compatible symptômes -Maternal PI Tache entière mm ADN QiaAmp modifié Mini kit de sang Qiagen Phénol chlorofom – – Conception de l’étude Population totale testée Séroprévalence chez les femmes enceintes dans le pays ou ethnique groupe,% Critères d’inclusion Nouveau-nés avec infection à CMV confirmée Taille de DBS utilisée, diamètre total Type d’extraction Sensibilité,% Spécificité,% Barbi et al Rétrospective – Symptômes compatibles – Disques PI internes mm Choc thermique – – Soetens et al [ ] Rétrospective UN ~ Criblage universel Point entier mm Phénol chloroforme NA Facile MAG BioMérieux NA Atkinson et al Rétrospective NA UN Infection à CMV confirmée Demi-point mm QiaAmp ADN Mini kit sanguin Qiagen – NA Boppana et al Prospective, & gt; Disques de criblage universels mm Qiagen M Qiagen – Étude actuelle Prospective ~ -Compatibilité symptomatique -Maternal PI Tache entière mm ADN QiaAmp modifié Mini kit de sang Qiagen Phenol chlorofom – – Note NA, non applicable; IP, infection primaire; UN, unknownView Grand

DISCUSSION

Pendant la période d’étude, la prévalence de l’infection CMV congénitale dans cette population était de% des patients, en accord avec les données précédemment publiées par notre groupe En outre, dans cette petite série, tous les DBS testés positifs avec les tests PCR CMV bien que cette population de nouveau-nés infectés par le CMV nés de mères infectées par le VIH n’ait pas été co-infectée par le VIH, elle pourrait ne pas être représentative de la population générale de nouveau-nés infectés par le CMV nés de femmes infectées par le CMV pendant la grossesse. des mères accroît le risque d’infection congénitale à CMV et pourrait également influencer la charge virale néonatale. La sensibilité des tests PCR du CMV pour le diagnostic de l’infection à CMV congénitale rapportée dans les plus grandes séries publiées dans la littérature va de% à% [, ,,] Parce que la comparaison entre les études est problématique , pour mieux comprendre le large éventail de sensibilité signalé, nous avons comparé les principales caractéristiques de ces ser Cette comparaison a permis d’identifier les principales raisons des écarts entre les séries: la taille de la DBS utilisée en plus grande taille pourrait expliquer une plus grande sensibilité, les différences dans les tests de PCR utilisés et les différences dans les populations testées. influencer la sensibilité du diagnostic de l’infection CMV congénitale dans le DBS Dans les populations de nouveau-nés présentant des symptômes ou nés de mères ayant eu une primo-infection CMV confirmée ou suspectée pendant la grossesse, la sensibilité de la PCR du CMV était très élevée. la DBS obtenue chez des nouveau-nés infectés congénitalement détectés par un programme de dépistage universel était aussi élevée que% dans une étude réalisée dans un pays où la femme enceinte présente une séroprévalence du CMV relativement faible. D’intérêt, dans cette étude, diagnostic de l’infection congénitale à CMV chez les nouveau-nés présentant une infection congénitale provenant de l’infection primaire maternelle Cette différence peut s’expliquer par le fait que les nouveau-nés nés de mères ayant des infections récurrentes peuvent avoir une faible charge virale qui pourrait rester non détectée par PCR de la DBS. étude importante de Boppana et al , la PCR de DBS avait une faible sensibilité% dans une population de nouveau-nés avec une infection détectée par le dépistage universel du CMV chez les nouveau-nés La proportion de nouveau-nés infectés après les infections maternelles secondaires n’a pas été rapportée dans cette étude. être élevé, car les nouveau-nés de cette étude sont nés de mères appartenant majoritairement à des groupes ethniques avec une séroprévalence élevée du CMV Cependant, le principal facteur de discordance entre les études est probablement les différences entre les méthodes d’extraction de l’ADN. différents protocoles d’extraction d’ADN de CMV et d’amplification de DBS ont clairement montré que certaines méthodes sont plus sensibles que d’autres s; comparaison des différentes méthodes d’extraction d’ADN sensibilités allant de% à% Différentes approches ont été proposées pour le dépistage de l’infection CMV congénitale: détection de tous les nouveau-nés infectés et détection de nouveau-nés infectés qui ont échoué Une stratégie de dépistage qui ne détecterait peut-être pas tous les nouveau-nés infectés mais qui détecterait les nouveau-nés infectés présentant un risque élevé de séquelles En effet, bien que les meilleures méthodes de dépistage du SBS manquent les nouveau-nés infectés avec peu ou pas de virémie. développer des séquelles sont virémiques à la naissance [,,,]; séquelles à long terme ayant été rapportées occasionnellement chez les nouveau-nés présentant une virémie faible ou nulle Par conséquent, la PCR CMV de la SCP est susceptible d’être une méthode très efficace pour identifier les nouveau-nés présentant un risque élevé de séquelles à long terme. L’utilisation d’échantillons de DBS serait la méthode la plus pratique et pourrait facilement être mise en œuvre en même temps que le programme de dépistage universel des nouveau-nés . Sur la base des résultats encourageants rapportés ici, d’autres études sont nécessaires. nécessaire pour évaluer la sensibilité du criblage à haut débit par PCR CMV de DBS pour identifier les nouveau-nés qui vont ultérieurement développer des séquelles. Nous remercions le Pr Paul Czernichow et Mme Valérie Gauthreau de l’Association Française pour le Dépistage et la Prévention des Handicaps de l’Enfant, pour leur aide pour récupérer les cartes Guthrie des laboratoires régionaux, et les parents des nouveau-nés pour leur consentement à participer à l’étude. le travail a été soutenu par la Fondation de l’Avenir Programme: ET-Conflits d’intérêts potentiels LG-K a reçu un paiement pour des conférences de DiaSorin CV-F a reçu une subvention de l’institution BioMérieux YV a reçu une subvention en son nom de Direction de la Recherche Clinique et consultant pour Sequenom Tous les autres auteurs: no conflict