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Progrès récents dans la détection en laboratoire du complexe Mycobacterium tuberculosis et de la pharmacorésistance

Le contrôle global de la tuberculose reste un défi du point de vue du diagnostic, de la détection de la pharmacorésistance et du traitement. Le traitement ne pouvant être initié que lorsque l’infection est détectée et basé sur les résultats des tests de sensibilité aux antimicrobiens, le développement et le test de nouveaux tests conçus pour détecter le complexe Mycobacterium tuberculosis, avec ou sans détection simultanée de résistance à l’isoniazide et / ou à la rifampine Les deux méthodes non moléculaires et moléculaires ont été développées. , dans le but principal de fournir des résultats de test plus rapides Les évaluations de dosages moléculaires ont généralement montré que ces tests ont une sensibilité variable pour détecter la présence du complexe M tuberculosis et, en particulier, sont insensibles lorsqu’ils sont utilisés avec des échantillons à frottis négatif; haute sensibilité pour détecter la résistance à la rifampicine; et sensibilité variable pour détecter la résistance à l’isoniazide

Les infections causées par le complexe Mycobacterium tuberculosis restent l’un des problèmes de santé publique mondiaux les plus importants: il y a eu des millions de cas de tuberculose, causant des millions de morts De ces cas, des millions de cas et de décès sont survenus chez des personnes infectées par le VIH. ont été estimés des cas de TB-MR multirésistante, ou% de tous les nouveaux cas de tuberculose, entraînant des décès Une tuberculose ultrarésistante XDR-TB a maintenant été confirmée dans les pays Les taux estimés d’incidence de la TB sont les plus touchés en Afrique subsaharienne et en Asie du Sud-Est, régions où les taux d’infection au VIH sont élevés et où les soins de santé sont insuffisants dans de nombreuses régions. Le diagnostic de la tuberculose est particulièrement important dans les régions où les patients ont un accès occasionnel ou intermittent aux soins de santé et aux sites où les prestataires ne sont pas en mesure d’attendre les résultats du laboratoire de référence. Avant même de suspendre ou d’initier une thérapie antituberculeuse. Malgré la nécessité de meilleurs tests diagnostiques, jusqu’à récemment, peu d’efforts ont été consacrés au développement de nouveaux tests pour le diagnostic de la TB. De nombreux laboratoires utilisent aujourd’hui les mêmes méthodes. il y a près d’un demi-siècle: taches conventionnelles telles que Ziehl-Neelsen ou Kinyoun pour la coloration des frottis d’expectoration, milieux à base d’œufs pour la culture et milieux solides pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens AST Bien qu’il soit plus fréquent pour les laboratoires d’utiliser des colorants fluorochromes et les milieux liquides pour les cultures, ces méthodes ne sont pas largement utilisées dans les petits hôpitaux ou cliniques en raison du besoin d’expertise technique et de matériel. Trop de laboratoires dans le monde n’ont pas accès à ces méthodes. parce qu’il est difficile de bien faire, le temps de rotation est souvent mesuré en mois, certaines drogues montrent souvent des Les résultats de dant en particulier l’éthambutol et l’AST pour les médicaments de seconde intention restent mal standardisés et peu disponibles. Il existe donc un besoin pressant de nouvelles méthodes permettant à la fois la détection rapide de la tuberculose chez les patients et l’AST pour l’identification des patients infectés. Pour résoudre ces problèmes, un certain nombre d’efforts sont en cours pour développer de nouvelles méthodes de diagnostic de la TB et de détection de la pharmacorésistance, y compris les méthodes non moléculaires et moléculaires. Cette mise à jour décrira certaines de ces méthodes et les limites pratiques de l’utilisation. ces essais sur le terrain

METHODES NON MOLECULAIRES

Un certain nombre de méthodes non moléculaires pour détecter le complexe M tuberculosis et / ou la résistance aux médicaments antimicrobiens ont été développées. Certaines de ces méthodes sont conçues pour améliorer la technologie existante, comme le traitement des échantillons et les frottis, d’autres reposent sur des technologies plus récentes. Premièrement, la microscopie des frottis est la méthode la plus largement utilisée pour le diagnostic de la tuberculose et, par conséquent, il existe une infrastructure largement répandue pour effectuer ce test. Deuxièmement, l’introduction de ces méthodes nécessiterait moins de ressources que l’introduction de nouvelles technologies Troisièmement, ces méthodes sont susceptibles d’être moins coûteuses que les nouvelles technologies Enfin, les professionnels de la santé connaissent bien ces méthodes, comment interpréter les résultats et les forces et les limites des méthodes. méthode d’essai insensible qui, malgré des décennies de formation et de développement d’infrastructures, n’a pas été Efficace pour aider à contrôler la tuberculose Les tests de sensibilité aux antimicrobiens sont encore plus problématiques, car ils ne sont pas disponibles dans de nombreuses régions où ils sont nécessaires.

Microscopie LED à diode électroluminescente fluorescente

En raison des limites de la microscopie optique conventionnelle utilisant des colorants comme Ziehl-Neelsen, des colorants fluorochromes tels que l’auramine ont été introduits pour améliorer la sensibilité du test et prendre moins de temps à effectuer. Cependant, la microscopie par fluorescence a besoin d’un microscope fluorescent. chambre noire, et une source de lumière coûteuse Les sources de lumière à vapeur de mercure utilisées pour ce type de microscopie peuvent également présenter un danger si les ampoules sont cassées. Pour surmonter ces limitations, la microscopie LED a été développée. La microscopie à LED est plus sensible et tout aussi spécifique, comparée à la lumière conventionnelle ou à la microscopie fluorescente L’Organisation Mondiale de la Santé L’OMS recommande que la microscopie à fluorescence conventionnelle être remplacé par la microscopie à LED, et que la microscopie LED devrait être mise en place graduellement une alternative pour la microscopie optique classique »

Susceptibilité microscopique des médicaments d’observation MODS Assay

Le test MODS est une méthode de microtitrage en bouillon conçu pour détecter le complexe M tuberculosis et détecter la résistance à l’isoniazide et à la rifampicine. La méthode utilise des plaques de microtitration standard et d’autres matériaux facilement disponibles dans les grands laboratoires de diagnostic. préparés contenant du milieu de bouillon Middlebrook H, des suppléments de croissance et des agents antimicrobiens pour prévenir la prolifération de contaminants bactériens Des médicaments antituberculeux, à différentes concentrations, sont ajoutés à certains des puits Les puits sont inoculés avec les échantillons cliniques, scellés pour empêcher la contamination, et examinés périodiquement pour la croissance. Les cultures positives pour les pathogènes montrent une croissance avec cordage; Le complexe M tuberculosis se distingue des autres mycobactéries qui présentent des filons, comme Mycobacterium chelonae, par la croissance plus rapide de ce dernier, bien que certaines études aient signalé une croissance plus rapide de M tuberculosis, ce qui pourrait mener à une mauvaise identification d’un isolat. M chelonae La détection de la résistance aux médicaments se fait par inhibition de la croissance dans les puits contenant des médicaments Les mycobactéries se développant plus rapidement dans les liquides que dans les milieux solides, la détection des bacilles tuberculeux peut se produire plus rapidement qu’avec d’autres méthodes de culture. Les agents TB permettent la détection rapide de la résistance aux médicaments Bien que le test MODS soit peu coûteux et simple, il convient mieux aux laboratoires plus importants disposant déjà d’une infrastructure pour les tests de diagnostic de la tuberculose. Niveau, et de l’équipement comme un microscope stéréoscopique, des réactifs et des fournitures qui m La méthode n’est pas encore standardisée Les caractéristiques de performance du test MODS ont été résumées dans une méta-analyse récente Pour la détection de la faible résistance à l’isoniazide, la sensibilité groupée du test est% et la spécificité est% Pour détection de résistance à l’isoniazide de haut niveau, la sensibilité diminue à%, mais la spécificité augmente à% Pour la détection de la résistance à la rifampicine, la sensibilité groupée est% et la spécificité est% Cette méta-analyse ne résume pas la capacité du test à identifier présence de M tuberculosis dans les échantillons d’expectoration La sensibilité publiée du test varie de% à%, bien que le test ait été comparé avec différents standards d’or dans ces études [-,] Le taux de contamination pour le test MODS, bien inférieur à celui des milieux solides , est supérieur à celui des milieux liquides

Dosages colorimétriques

Une méthode colorimétrique pour détecter la croissance microbienne dans des souches pharmacorésistantes a été décrite et ensuite évaluée dans un nombre limité d’essais cliniques Le test est basé sur l’observation que les bacilles tuberculeux en croissance convertissent un colorant jaune [-, – diméthylthiazol– yl -, – bromure de diphényl tétrazolium ou MTT] à une couleur violette qui peut être détectée visuellement ou en utilisant un spectrophotomètre. Dans les essais sur le terrain, il a été démontré que la méthode présente un haut degré de concordance avec les AST conventionnels. ont été comparés à un test de réduction des nitrates et à un test à la résazurine pour détecter la résistance à l’isoniazide, à la rifampicine, à l’éthambutol et à la streptomycine; des résultats similaires ont été obtenus pour l’isoniazide et la rifampicine, mais seul le test de réduction des nitrates a montré un haut niveau de concordance avec tous les médicaments de première ligne Bien que ces méthodes soient conceptuellement simples, elles sont surtout utiles dans les grands laboratoires. capacité à effectuer des tests plus complexes

MDR-XDR TB Test de couleur

Ce test est basé sur la technologie Agar TLA à couche mince, avec culture et méthode AST directe sur une seule plaque d’agar. Ce test TLA particulier est basé sur les changements de couleur dans les quadrants de la plaque, avec quadrant pour la détection de croissance et les autres quadrants Il n’y a que des données publiées limitées sur les tests TAL en tant que groupe [, -] et aucune donnée publiée concernant les caractéristiques de performance du test MDR-XDR TB Les données disponibles suggèrent que les tests TLA ont haute sensibilité et spécificité pour détecter la résistance aux médicaments [, -] et que le taux de contamination pour les tests TLA semble être beaucoup plus faible que celui des milieux solides ou liquides

Autres méthodes non moléculaires

D’une manière générale, ce dernier groupe de méthodes est basé sur des changements incrémentiels des méthodes d’essai standard et vise à modifier les méthodes existantes pour augmenter leur disponibilité pour les laboratoires ayant des ressources limitées et à améliorer le temps d’exécution des tests. les méthodes ont donné des résultats variables Par exemple, une méthode, la méthode universelle de traitement des échantillons, a montré une sensibilité plus élevée pour la microscopie des frottis, comparée à la méthode standard n-acétyl-l-cystéine, pour améliorer la détection des bacilles acido-résistants Dans une évaluation subséquente, cependant, les résultats de la culture mycobactérienne étaient plus souvent négatifs avec la méthode USP, il n’y avait pas de différence dans la contamination. les taux entre les méthodes et la sensibilité des frottis n’étaient pas significativement différents Dans l’ensemble, les évaluations de ces diverses méthodes ont montré les mycobactéries, mais ce qu’il faut ensuite, ce sont des essais cliniques qui comparent directement chaque méthode pour voir quelles sont les meilleures et les analyses coûts-avantages de chaque méthode.

MÉTHODES MOLÉCULAIRES

Un certain nombre de tests moléculaires ont été conçus pour détecter la présence de M tuberculosis et détecter la résistance à l’isoniazide et / ou à la rifampine. Les avantages potentiels des tests moléculaires sont la capacité de concevoir des tests hautement sensibles et spécifiques; fabriquer certains dosages en grandes quantités, ce qui permet de réduire les coûts et de faciliter la normalisation de l’utilisation sur le terrain; donner des résultats rapides; Ces avantages potentiels doivent être comparés aux inconvénients de ces tests, dont certains sont communs à tous les dosages moléculaires et d’autres spécifiques à des dosages particuliers. les inconvénients des dosages moléculaires sont le besoin d’une infrastructure de laboratoire pouvant accommoder les tests moléculaires, le coût, un besoin continu de cultures pour l’AST, et la plupart fonctionnent mieux avec des échantillons à frottis positif qu’avec des échantillons à frottis négatif.

Tests de sonde de ligne

Cette technologie implique une série d’étapes comprenant l’extraction de l’ADN des isolats mycobactériens ou directement des échantillons cliniques, amplification en chaîne par polymérase des séquences d’acides nucléiques, hybridation des produits de PCR marqués avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées sur une bande, et développement colorimétrique permettant les lignes. Pour voir où se situent les sondes, le terme «test sonde de ligne» In, l’OMS a publié une déclaration de politique concernant les tests de ligne-sonde moléculaire pour la détection de M tuberculosis et pour la détection de résistance aux médicaments Ce document décrit la technologie et l’infrastructure nécessaire pour effectuer le test et fait des recommandations politiques concernant l’utilisation du test. Le premier test de ligne-sonde était le INNO-LiPA Rif TB Innogenetics NV Les résultats des évaluations cliniques du test indiquaient qu’il détecte avec précision la résistance à la rifampicine, mais certaines des évaluations ont montré que le test était moins sensible pour la détection du complexe M tuberculosis Une méta-analyse réalisée a montré que des études publiées ont montré une sensibilité>% avec une spécificité de% mais que, dans les études dans lesquelles le test a été appliqué à des échantillons cliniques, la sensibilité variait de % à% Une étude a montré que le test pouvait être utilisé avec succès dans un environnement pauvre en ressources, comparé à un laboratoire de référence Le second test de sonde linéaire était le GenoType MTBDR Hain Lifescience le test GenoType MTBDR, mais les premières évaluations ont montré que le test ne détectait pas suffisamment la résistance aux médicaments, détectant seulement% -% des isolats avec la rifampicine ou une faible résistance à l’isoniazide Le test a finalement été modifié. Les mutations rpoB et inhA, avec le nom GenoType MTBDRplus Bien que les évaluations du nouveau test ont montré une amélioration de la détection de la résistance à l’isoniazide , d’autres évaluations ont montré que la détection de la résistance à l’isoniazide est restée sous-optimale, en particulier pour les souches à faible résistance Une méta-analyse effectuée a confirmé ces résultats; le test montre une haute sensibilité et spécificité pour détecter la résistance à la rifampicine mais des résultats variables pour détecter la résistance à l’isoniazide Une seconde méta-analyse réalisée l’année suivante a montré des résultats similaires, bien que dans cette analyse, la sensibilité du test GenoType MTBDRplus sensibilité dans la détection de la résistance à l’isoniazide Globalement, les résultats de ces évaluations indiquent que le test est peu utilisé avec des échantillons à frottis négatif et que la détection de la résistance à l’isoniazide est plus variable mais généralement inférieure à celle de la résistance à la rifampine. pour détecter la résistance aux fluoroquinolones, à l’éthambutol, à la kanamycine, à l’amikacine et à la capréomycine Deux évaluations de ce test ont montré des résultats prometteurs mais variables pour la détection de la résistance aux médicaments de deuxième intention

Amplification isotherme à médiation par boucle

L’essai d’amplification isotherme à médiation en boucle Eiken Chemical Company repose sur une nouvelle forme d’amplification d’acide nucléique avec une efficacité suffisante pour générer suffisamment d’ADN pour permettre la détection par inspection visuelle de la fluorescence. La méthode a été évaluée sur une base limitée. avoir une sensibilité élevée pour les échantillons à frottis positif mais une faible sensibilité pour les échantillons à frottis négatif

Oligonucléotide Microarray

La technologie des microréseaux oligonucléotidiques permet la détection simultanée de multiples séquences génétiques, qui peuvent être utilisées pour détecter des séquences conservées pour la détection de microorganismes et / ou la détection de mutations dans des séquences qui confèrent la résistance aux médicaments d’un isolat, The TB-Biochip L’Institut Engelhardt de biologie moléculaire, a été évalué pour la capacité du système à détecter la résistance à la rifampicine dans M tuberculosis Dans une petite étude comparant le microréseau à AST conventionnelle, le test a montré une sensibilité de% pour détecter la résistance à la rifampine.

Xpert MTB / RIF

Le test Xpert MTB / RIF Cepheid est un dispositif de PCR rapide auto-clos qui, dans une certaine mesure, atténue de nombreuses limitations des autres tests moléculaires Ceci est principalement dû au fait que le dispositif est auto-clos et nécessite donc moins Dans une évaluation limitée, le test s’est avéré être% sensible pour détecter les isolats à frottis positif mais seulement% sensible pour détecter les isolats à frottis négatif positifs pour la culture . un plus grand essai sur le terrain, le test s’est avéré être% sensible pour l’identification des isolats positifs pour la culture, mais seulement% sensible pour l’identification des isolats positifs à la culture à frottis négatif; le test avait une spécificité rapportée de% Dans cette étude, pour les isolats qui étaient à frottis négatif mais culture positive, en ajoutant un second test MTB / RIF, la sensibilité a augmenté de%; l’ajout d’un troisième test MTB / RIF a augmenté la sensibilité d’un% supplémentaire pour une sensibilité totale de% Dans la même étude, le test s’est montré très sensible pour détecter la résistance à la rifampine, identifier correctement les isolats résistants à la rifampine et% des isolats sensibles à la rifampicine Un inconvénient évident de ce système est l’impossibilité de tester et de détecter la résistance à l’isoniazide. Les autres inconvénients potentiels comprennent le coût et, bien que dans une moindre mesure, les essais en ligne. L’OMS a approuvé l’utilisation de ce test

LIMITES PRATIQUES D’ESSAIS DIAGNOSTIQUES RAPIDES

Malgré leur rapidité d’exécution, leur coût relativement bas par test et leur apparente simplicité d’utilisation, les tests de diagnostic rapide ont des limites importantes. Premièrement, aucun des tests n’élimine le besoin de cultures mycobactériennes. Troisièmement, de nombreux tests moléculaires ne fonctionnent bien qu’avec des échantillons à bacilloscopie positive, ce qui pose le plus de problèmes en Afrique subsaharienne, où de nombreux pays infectés par le VIH sont infectés par le VIH. Les patients atteints de tuberculose sont à bacilloscopie négative Enfin, le coût déclaré des tests, bien que relativement faible, est compensé dans une certaine mesure par le besoin d’infrastructures adéquates. En raison de ces limitations, l’utilisation de ces tests sur le terrain est susceptible d’être limitée Lorsque les gouvernements ou d’autres programmes de santé fournissent un financement suffisant pour développer et maintenir une infrastructure nécessaire, il est probable que Les tests ne seront pas largement utilisés dans les cliniques et les hôpitaux ruraux. La coordination du développement et de l’utilisation de nouveaux tests pour le diagnostic de la tuberculose devrait être une priorité. Une autre considération importante dans l’utilisation des tests rapides est de savoir si un effet important sur les résultats des soins aux patients Comme indiqué dans une évaluation du traitement antituberculeux au Pérou, le temps d’attente du test n’est qu’un élément de l’évaluation et du traitement des patients tuberculeux car de nombreux autres facteurs influent sur et traiter les patients, les diminutions progressives du délai d’exécution du test peuvent ne pas avoir l’effet désiré à moins que des changements ne soient apportés au processus global de soins aux patients

RÉSUMÉ

Un certain nombre de nouvelles méthodes et dosages ont été développés pour la détection de M tuberculosis, avec ou sans détection de résistance aux médicaments. Cependant, les méthodes rapides ne remplacent pas la culture, la plupart ne sont pas fiables lorsqu’elles sont utilisées avec des échantillons à frottis négatif; AST conventionnel est toujours nécessaire pour confirmer les cas de XDR-TB; pour tester la résistance aux médicaments autres que l’isoniazide et la rifampicine, aucune des méthodes ne permet de détecter toutes les souches résistantes; et dans de nombreuses parties du monde, l’infrastructure existante est insuffisante pour que ces tests puissent être utilisés de manière généralisée. De plus, il n’est pas encore clair que l’utilisation de ces tests, sans autres changements dans les programmes généraux de diagnostic et de traitement, sur le contrôle de la tuberculose nécessaire dans de nombreuses régions Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit