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La production différentielle d’interféron-γ caractérise les réponses de cytokine aux Leishmania et aux antigènes de Mycobacterium leprae dans la leishmaniose mucocutanée concomitante et la lèpre lépromateuse

Contexte La leishmaniose tégumentaire et la lèpre présentent des spectres similaires de phénotypes pathologiques qui dépendent de l’immunité cellulaire à des antigènes spécifiques La leishmaniose cutanée diffuse et la lèpre lépromateuse représentent l’extrémité anergique du spectre, tandis que la leishmaniose cutanéo-muqueuse et la lèpre tuberculoïde sont associées à des antigènes spécifiques. Nous avons caractérisé et comparé la réponse cellulaire aux antigènes de Leishmania et de Mycobacterium leprae chez un patient présentant une association intrigante de leishmaniose cutanéo-muqueuse avec la lèpre lépromateuse, aux extrémités opposées des spectres immunopathologiques de ces maladies. tests cutanés et évaluation de la prolifération cellulaire et de la production de cytokines des cellules mononucléaires du sang périphérique PBMCsRésultats Des réactions cutanées fortes et une prolifération de PBMC ont été observées en réponse à des antigènes de Leishmania mais pas à des antigènes de M leprae. Les antigènes de Leishmania et M leprae ont induit des niveaux comparables de facteur de nécrose tumorale-α, interleukine et interleukine- Cependant, la réponse interféron-γ aux antigènes de Leishmania était remarquablement élevée et celle aux antigènes M de la lèpre presque nulle. et la leishmaniose tégumentaire peut produire des formes polaires opposées associées respectivement à des réponses immunitaires à médiation cellulaire absentes ou exagérées à chaque pathogène. Cela suggère que des mécanismes indépendants influencent le résultat clinique de chaque infection. De plus, l’interféron-γ semble jouer un rôle majeur dans la l’expression de ces infections intracellulaires

La lèpre et la leishmaniose tégumentaire américaine sont toutes deux causées par des organismes intracellulaires Ces maladies sont caractérisées par un spectre de manifestations cliniques qui dépendent de l’immunité à médiation par les lymphocytes T. L’extrémité hyperergique du spectre est caractérisée par la rareté des Réponses induites par les antigènes de Mycobacterium leprae ou de Leishmania, démontrées par des taux élevés de prolifération des lymphocytes T in vitro induite par un antigène spécifique et par de fortes réactions cutanées à la lépromine ou à la leishmaniose , D’autre part D’autre part, l’extrémité anergique du spectre, représentée par la lèpre lépromateuse et la leishmaniose cutanée diffuse, est caractérisée par l’absence d’immunité à médiation cellulaire spécifique des agents pathogènes et par un nombre massif de bacilles intracellulaires ou de parasites. sous-ensembles, les cellules Th et les cellules Th, sur la base du répertoire des lymphokines qu’ils produisent après stimulation avec des antigènes Les cellules Th, qui produisent IFN-γ et IL-, sont associées à une protection contre les pathogènes intracellulaires, alors que les cellules Th, qui produisent IL-, IL-, et IL-, sont impliquées dans l’aggravation et les manifestations pathologiques des infections intracellulaires IFN-γ, un produit caractéristique du sous-ensemble Th des cellules CD, active les macrophages pour tuer les microbes intracellulaires, tels que Leishmania et M leprae Les patients qui ont des formes cliniques hyperergiques, comme la lèpre tuberculoïde et la leishmaniose muqueuse, ont des niveaux plus élevés de production d’IFN-γ que les patients présentant d’autres formes dans les spectres cliniques de ces maladies le TNF-α synergise avec l’IFN-γ dans l’élimination des principaux amastigotes de Leishmania par les macrophages activés. et participer à la destruction des mycobactéries par les macrophages Bien qu’un rôle protecteur ait été proposé pour le TNF dans la leishmaniose murine expérimentale , les patients atteints de formes sévères de leishmaniose s, soit des leishmanioses cutanées viscérales ou diffuses, soit des formes pauciparasitiques, c’est-à-dire des leishmanioses cutanéo-muqueuses, ont des taux sériques de TNF-α significativement plus élevés que les formes bénignes, à savoir la leishmaniose cutanée localisée et la leishmaniose subclinique. les taux les plus élevés de TNF-α sérique ont été retrouvés chez des patients atteints de lèpre lépromateuse à forme multibacillaire . Bien que IL- ait été associé à un phénotype non guérisseur dans la leishmaniose murine , son rôle est moins clair chez les humains. D’autre part, un rôle aggravant a été suggéré pour IL- dans la leishmaniose humaine, ainsi que dans la lèpre lépromateuse Nous avons caractérisé et comparé la réponse aux antigènes de Leishmania et M leprae chez un patient avec une lèpre lépromateuse. cas inhabituel de leishmaniose cutanéo-muqueuse associée et de lèpre lépromateuse, formes polaires opposées dans les spectres immunopathologiques de ces infections intracellulaires par des tests cutanés et l’évaluation de la prolifération des PBMC et de la production de cytokines

Rapport de cas

Un homme d’un an, né dans l’État de Bahia, au Brésil, et vivant dans l’État de Rio de Janeiro depuis son plus jeune âge, examiné en décembre dans une unité de soins primaires, présentant un érythème noueux, une infiltration cutanée et une madarose. Le patient était un ouvrier agricole et un abuseur d’alcool avec une insuffisance cardiaque congestive La lèpre lépromateuse a été diagnostiquée Le régime de polychimiothérapie recommandé par l’Organisation mondiale de la Santé OMS, consistant en une administration mensuelle surveillée de mg de rifampine, de mg de clofazimine et de -administration de mg dapsone et de mg clofazimine a été initiée mais irrégulièrement utilisée par le patient En mai, une lésion nasale a été notée Cette lésion ne s’est pas améliorée avec la polychimiothérapie pour la lèpre, donc le patient a été référé à l’hôpital Evandro Chagas Rio de Janeiro en juillet pour une investigation de l’étiologie de sa maladie A l’admission, un examen dermatologique a révélé une madarose bilatérale, une xérose, une plaque et un œdème de la main gauche, infiltration des narines et ulcération avec destruction partielle de la figure du septum nasal ordonner ici. Le patient avait également une cicatrice atrophique de cm de diamètre sur la face postérieure de l’oreille droite, avec perte d’une petite partie de l’oreille. lobule, qui avait résulté d’un ulcère cutané chronique qui s’était développé chez le patient dans l’état de Roraima en Amazonie. Un examen physique a révélé une pression artérielle de × mm Hg, une cardiomégalie, un souffle systolique mitral de faible intensité, une hépatomégalie, et pas d’œdème des membres

Figure Vue largeDownload slidePhotographie d’un patient présentant une leishmaniose mucocutanée concomitante et une lèpre lépromateuse montrant la perte du tiers externe de la flèche sourcilière, une caractéristique de la lèpre lépromateuse polaireFigure View largeTélécharger la diapositivePhotographie d’un patient atteint de leishmaniose cutanéo-muqueuse concomitante et de lèpre lépromateuse de la flèche des sourcils, une caractéristique de la lèpre polaire lépromateuse

Figure Vue largeDownload slidePhotographies du patient montrant une lésion cutanéo-muqueuse cutanée qui a partiellement détruit la cloison nasaleFigure Vue largeDownload slidePhotographies du patient montrant une lésion muco-cutanée de leishmaniose qui a partiellement détruit la cloison nasaleLes valeurs sanguines du laboratoire étaient les suivantes: hémoglobine, g / L; Nombre de globules blancs, × cellules / L; nombre total de lymphocytes, × cellules / L; nombre d’éosinophiles, × cellules / L; numération plaquettaire, × plaquettes / L; azote uréique sanguin, mg / dL; créatinine, mg / dL; et glucose, mg / dL Les résultats des tests de la fonction hépatique étaient normaux, avec un taux d’amylase de mg / dL et un niveau de lipase de mg / dL Les tests sérologiques étaient négatifs pour le test de dépistage du Vénérien et un test d’hémagglutination de Treponema pallidum. Résultats négatifs Un test d’immunofluorescence indirecte anti-Leishmania a donné un titre positif d’examen parasitologique des échantillons de selles révélant la présence de larves de Strongyloides stercoralis Urinalysis montrant une protéinurie par analyse de bandelette thoracique Une radiographie thoracique a révélé une hypertrophie cardiaque L’électrocardiographie et l’échocardiographie ont révélé des signes de cardiomyopathie dilatée sévère L’examen des voies respiratoires supérieures avec un endoscope fibroscopique flexible a révélé une inflammation intense dans la cloison nasale droite; œdème du septum, cordes vocales et luette; hyperémie des muqueuses nasales; et nodules lépromateux dans la figure du palais mou

Figure Vue largeDisque de téléchargement Image endoscopique fibroscopique montrant de multiples flèches de lépromas dans le voile du palaisFigure View largeDownload slide Image endoscopique fibroscopique montrant plusieurs flèches de lépromas dans le palais mouLa lèpre lépromateuse polaire a été confirmée sur la base de résultats positifs de frottis d’échantillons de peau obtenus bilatéralement à partir des lobes de l’oreille. coudes et genoux, avec un indice bactérien moyen de coloration de Ziehl-Nielsen La leishmaniose cutanéo-muqueuse a été diagnostiquée par isolement de Leishmania à partir d’une biopsie de la lésion nasale. Les parasites qui ont été cultivés dans le milieu Novy-McNeal-Nicolle ont été identifiés comme Leishmania braziliensis par utilisation de l’analyse des isoenzymes Meglumine antimoniate Glucantime; Aventis a été administré par voie intraveineuse pour le traitement de la leishmaniose avec un calendrier de faible dose de mg / kg par jour d’antimoine pentavalent pendant des jours Ce schéma a été choisi pour sa toxicité relativement faible, en raison de préoccupation de la cardiomyopathie alcoolique du patient. tous les deux jours par électrocardiographie pour le calcul de l’intervalle QTc, et des tests sanguins pour évaluer les fonctions rénales et hépatiques ont été effectués chaque semaine. La polychimiothérapie, comme décrite ci-dessus, a été administrée pour traiter la lèpre. mutilation partielle des narines Au moment de la rédaction de ce rapport, le patient recevait toujours une polychimiothérapie régulière et ne présentait aucune activité de la maladie, et les frottis cutanés de suivi présentaient un indice bactérien de

Méthodes

Tests cutanés Le test à la lépromine a été réalisé comme suit: mL d’une suspension de bacilles dérivés du tatouage autoclavés × bactéries / mL – produite par la Fondation Oswaldo Cruz Rio de Janeiro, Brésil conformément aux directives de l’OMS – a été injectée par voie intradermique sur la face interne de l’avant-bras, les réactions de Fernandez et Mitsuda ont été définies par la présence d’une induration cutanée de ⩾ mm, h et semaines après l’inoculation de l’antigène Le test cutané à la leishmanine a été réalisé comme suit: La souche de référence OMS IFLA / BR // promastigotes de PH, contenant μg d’azote total par millilitre de PBS avec% de phénol Bio-Manguinhos, a été injectée par voie intradermique sur le côté interne de l’avant-bras Une induration avec un diamètre de ⩾ mm h après inoculation de l’antigène être une réaction positive au MonténégroLaboratoires de laboratoireLes extraits d’antigènes bruts de Leishmania et de M leprae ont été utilisés dans les essais in vitro. L braziliensis Cette souche MHOM / BR // et L amazonensis de référence OMS IFLA / BR // PH ont été cultivées séparément en milieu Novy-McNeal-Nicolle , complétées par du milieu RPMI Sigma et du sérum de veau foetal inactivé par la chaleur Sigma. Les parasites ont été lavés fois par centrifugation à g pour min à ° C dans du PBS et ont été perturbés par des cycles répétés de congélation et de décongélation, suivie par ultrasonication Ultra-tip Labsonic System; Lab-Line à watts pour min dans un bain de glace Une préparation entière de l’antigène M leprae irradié, dérivée du tatou x bactéries / mg; aimablement fourni par Drs EP Sampaio et MC Pessolani, Laboratoire de Lèpre, Fondation Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brésil, a été soniqué selon le même protocole utilisé pour les extraits antigéniques Leishmania La concentration d’antigène dans chaque préparation a été ajustée à mg / ml protéine azote Tous les échantillons ont été conservés à -0 ° C jusqu’à leur utilisation. Des PBMC ont été obtenus à partir d’échantillons de sang veineux par centrifugation à travers un gradient Ficoll-Hypaque Sigma et ont été remis en suspension dans du milieu RPMI Sigma supplémenté avec% sérum AB Rh inactivé thermiquement, mmol / L HEPES, mmol / L L-glutamine, mmol / L -mercaptoéthanol et antibiotiques IU / mL de pénicilline et mg / mL de streptomycine tous de chez Sigma et ajustés aux cellules / mL La réponse proliférative des PBMC a été évaluée dans des puits de culture en triple dans des plaques de microtitration à fond plat. des plaques, contenant la suspension cellulaire dans un volume final de μL / puits en présence de concanavaline A ConA; μg / mL ou des extraits antigéniques de L braziliensis, L amazonensis ou M leprae μg / mL ou sans stimuli, ont été incubés pendant plusieurs jours à ° C dans une atmosphère humidifiée de CO. La prolifération cellulaire a été estimée par incorporation de [H] -thymidine, comme décrit. Les niveaux de cytokine dans les surnageants des deux cultures PBMC qui ont été stimulés avec des extraits d’antigènes de Leishmania ou de M leprae ou avec ConA et PBMC ont été exprimés comme des indices de stimulation. les cultures non stimulées ont été mesurées par ELISA. Les PBMC ont été cultivées dans des plaques à fond plat Nunc dans un volume final de mL / puits et ont été stimulées in vitro comme décrit ci-dessus. Les comptages cellulaires moyens pour des cultures en triple ont été comparés aux avec recombinant IL-, IL-, TNF-α et IFN-γ Pharmingen Suite à un protocole précédemment établi dans notre laboratoire données non montrées, les surnageants ont été collec Le jour pour la détermination des taux de TNF-α, le jour pour les taux d’IL-, le jour pour les taux d’IL-, et le jour pour les niveaux d’IFN-γ, et tous les surnageants ont été conservés à-° C jusqu’à leur utilisation. Le test ELISPOT a été utilisé pour comparer les fréquences des cellules productrices d’IFN-y après stimulation avec des antigènes de Leishmania ou de M leprae. Les plaques de fluorure de polyvinylidène Millipore ont été recouvertes de μg d’anticorps monoclonal anti-IFN-γ de souris Pharmingen par puits. incubation à ° C, les puits ont été lavés avec du PBS et les sites occupés ont été bloqués avec du milieu RPMI additionné de% de sérum fœtal bovin, mmol / L L-glutamine, et% de pénicilline / streptomycine Sigma PBMCs / cellules ont été préincubées dans le présence ou absence des extraits antigéniques μg / mL ou ConA μg / mL, dans un volume final de μL / puits, pour h à ° C dans une atmosphère de% CO. Les cellules ont ensuite été transférées dans les plaques de fluorure de polyvinylidène pré-enrobées. ° C dans une atmosphère de% CO, les cellules ont été retirées, et l’anticorps monoclonal biotinylé anti-IFN-γ Pharmingen a été ajouté μg / μL Quatre heures plus tard, la plaque a été lavée, et μL de streptavidine-phosphatase alcaline BioRad diluée à un rapport de: Dans chaque puits, après h à ° C, la plaque a été lavée à nouveau et incubée avec le substrat tampon Tris μL – phosphate de bromo – chloro – indolyle / nitrobleu tétrazolium Sigma, pour – min à ° C. microscopie stéréoscopique

Résultats

Tests cutanés Une réaction positive au Monténégro, c’est-à-dire un test de leishmanine, a été observée avec un diamètre moyen de mm d’induration cutanée. Le test cutané à la lépromine n’a donné aucune réaction de Fernandez ou de Mitsuda.

Figure Vue largeDownload slidePhotographie montrant une forte réaction d’hypersensibilité retardée au test cutané à la leishmanine, se présentant comme une grande zone d’induration cutanée lignes blanches et lésions vésiculaires flèche au site d’inoculation d’antigènesFigure View largeTélécharger diapositivePhotographie montrant une forte hypersensibilité retardée réaction au test cutané à la leishmanine, se présentant comme une large zone d’induration cutanée lignes blanches et lésions vésiculaires flèche au site d’inoculation d’antigènesLaboratoires Les résultats de laboratoire donnés ici sont représentatifs de plusieurs expériences, dans le cas de la réponse proliférative et ELISA, et dans le cas d’ELISPOT Les réponses prolifératives induites par l’index de stimulation des antigènes L braziliensis, et par l’indice de stimulation ConA, étaient fortes, contrairement à la réponse proliférative induite par les antigènes Mpepre, qui était un indice de stimulation insignifiant. indice, à celui induit par L antigènes de braziliensis Les taux de TNF-α, IL- et IL- mesurés dans les surnageants des cultures de PBMC stimulées avec les antigènes L braziliensis et M leprae étaient similaires. Cependant, la réponse de l’IFN-γ aux antigènes de L braziliensis était & gt; Les niveaux de cytokines dans les cultures qui ont été stimulées avec les antigènes de L amazonensis non représentés étaient équivalents à ceux observés dans les cultures qui ont été stimulées par LA. Un test ELISPOT a été réalisé pour comparer davantage les réponses IFN-γ des PBMC aux antigènes Leishmania et M leprae. La fréquence des cellules productrices d’IFN-γ était de / cells après stimulation par les antigènes L braziliensis, qui était> fréquence observée en présence de l’activateur des cellules T polyclonaux ConA / cellules La fréquence observée après stimulation avec l’antigène L amazonensis était encore plus élevée, aux cellules / Contrairement aux fréquences élevées observées après stimulation avec les antigènes de Leishmania, aucune cellule productrice d’IFN-γ n’était détectée. détecté après stimulation avec l’antigène M leprae

Figure View largeTélécharger les niveaux de la cytokine dans les PBMC cultivées en présence de Mycobacterium leprae Ml ou Leishmania braziliensis Lb extraits d’antigènes entiers ou concanavaline A ConA, ou sans stimulus ws, tel qu’évalué par ELISAFigure View largeTélécharger les niveaux de Glucokine dans les PBMC cultivées en présence de Mycobacterium leprae Ml ou Leishmania braziliensis Lb extraits d’antigènes entiers ou concanavaline A ConA, ou sans stimulus ws, tel qu’évalué par ELISA

Discussion

En dépit du chevauchement géographique de la leishmaniose et de la lèpre, les signalements de leishmaniose concomitante et de lèpre ont été relativement rares, et la plupart des rapports comportaient des aspects cliniques et diagnostiques . Ces maladies présentent un spectre de formes cliniques paucibacillaires / parasitaires. comme la lèpre tuberculoïde et la leishmaniose cutanée localisée, représentent l’expression de la résistance relative de l’hôte qui est due aux réponses conservées des lymphocytes T aux antigènes M de Leprae ou Leishmania, et ces formes sont associées à un meilleur pronostic, une bonne réponse à la thérapie, et même D’autre part, les formes multibacillaires / parasitaires, la lèpre lépromateuse et la leishmaniose cutanée diffuse sont caractérisées par la suppression spécifique des pathogènes des réponses induites par les lymphocytes T, la progression incontrôlée de l’infection et une mauvaise réponse à l’auto-guérison. thérapie Les réponses immunitaires spécifiques de Leishmania chez les patients atteints de leishmaniose muqueuse s sont fortement biaisés vers le pôle Th et significativement plus forts que ceux observés chez les patients atteints de leishmaniose cutanée localisée [,,] Ces réponses régulées de type Th sont associées à des lésions tissulaires chroniques et sévères, ainsi qu’à une pénurie de parasites dans les lésions muqueuses Les similitudes de la lèpre et de la leishmaniose cutanée, en termes de leurs aspects cliniques, immunologiques et pathologiques, ont justifié la recherche d’une base immunogénétique commune de susceptibilité à ces infections intracellulaires Sur la base de ce point de vue, la survenue d’infections mycobactériennes et leishmaniennes concomitantes a été interprétée comme le résultat d’une immunité à médiation cellulaire altérée conduisant à une susceptibilité particulière à ces maladies Cependant, l’accumulation de preuves indique que l’immunodéficience associée à la lèpre lépromateuse est spécifique à l’infection à M leprae. À notre connaissance, ceci est le premier rapport d’association de multibacilla anergique Nous avons découvert que la lèpre concomitante et la leishmaniose tégumentaire peuvent entraîner des formes polaires opposées associées respectivement à des réponses immunitaires à médiation cellulaire absentes ou exagérées au pathogène spécifique. Cela suggère que la lèpre concomitante et la leishmaniose tégumentaire des mécanismes indépendants influencent les résultats cliniques de chaque infection. En outre, parmi les différentes cytokines testées, la seule différence nette observée était dans les taux d’IFN-γ produits en réponse aux antigènes de Leishmania et M leprae, indiquant un rôle clé de cette cytokine dans le développement clinique. Expression de ces maladies Comme le révèlent les paramètres évalués, à savoir la réactivité cutanée, la prolifération des PBMC et la production d’IFN-γ, les réponses cellulaires induites par les antigènes de Leishmania sont très fortes, comme on l’observe communément dans la leishmaniose cutanéo-muqueuse [, D’autre part, les réponses correspondantes qui étaient Les antigènes de M leprae étaient presque nuls, comme on peut s’y attendre chez un patient atteint de lèpre lépromateuse polaire Cependant, les cellules de patients atteints de lèpre paucibacillaire étaient capables de proliférer et de produire de l’IFN-γ en réponse à antigène leprae qui a été utilisé des données non montrées Pour expliquer l’anergie spécifique des cellules T chez les patients atteints de lèpre lépromateuse, un rôle immunosuppresseur pour les cellules T CD, IL-, et IL- a été suggéré Dans notre enquête, l’absence de cellules la prolifération et la production d’IFN-γ dans les cultures de PBMC de ce patient qui ont été stimulées par l’antigène M leprae ne pouvaient pas être attribuées à l’inhibition médiée par l’IL, car les concentrations de cette cytokine dans de telles cultures étaient similaires à celles trouvées dans les cultures PBMC. stimulé par la présence d’antigènes de Leishmania De plus, la présence d’anticorps anti-IL-anticorps neutralisants n’a pas augmenté les taux d’IFN-γ ni la prolifération cellulaire dans les cultures stimulées par M antipepte. n données non montréesDes études complémentaires sont nécessaires pour comprendre la pathogenèse de la leishmaniose tégumentaire et de la lèpre américaines et, en particulier, pour déterminer les similitudes et les différences dans les mécanismes immunologiques impliqués dans leur expression clinique

Remerciements

Soutien financier DSM est récipiendaire d’une bourse de chercheur invité de la Fondation Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro Faperj, Brésil SCFM et AS sont investigateurs du Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, en association avec lequel ils ont reçu bourses d’études pour chercheurs expérimentés Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit