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Détermination de la charge et du type de VPH du virus du papillome humain dans les lésions cervicales de haut grade réséquées chirurgicalement chez des femmes infectées par le VIH pendant le suivi de l’infection par le VPH

Contexte Le rôle de la charge virale du papillomavirus humain et l’importance des infections à HPV à souches multiples en tant que biomarqueurs pour le développement de la maladie cervicale ont été évalués chez des femmes séropositives pour le virus de l’immunodéficience humaine. Des échantillons ont été analysés. les femmes qui ont subi une résection chirurgicale du cône cervical pour le traitement d’un néoplasme cervical intraépithélial de haut grade confirmé histologiquement et qui ont été obtenues chez des femmes séropositives ayant un VPH à haut risque mais un contrôle négatif de la colposcopie. Chaque patient a subi des examens périodiques. – un intervalle de mois incluant colposcopie, test de Papanicolaou, biopsie si nécessaire, et brossage cervical pour le test HPV. Le typage viral a été réalisé par hybridation dot blot inverse et quantification de la charge virale par PCR interne en temps réel et analyses commerciales. échantillons de brosse cervicale recueillis lors de l’injection intraépithéliale malpighienne de haut grade des oes ont été diagnostiqués ont révélé que tous les cas avaient des charges de VPH significativement supérieures à celles des témoins P = et P =, par PCR et l’indice Hybrid Capture [Digene], respectivement. Des concentrations décroissantes de charge HPV ont été observées en comparant les échantillons obtenus avant et après traitement P & lt; Le nombre et le type de souches de VPH détectées n’étaient pas statistiquement différents entre les cas et les témoins. Conclusions La charge de VPH significativement plus élevée détectée chez les femmes atteintes de dysplasie cervicale de haut grade, ainsi que la diminution importante de la charge après l’ablation chirurgicale de la lésion suggèrent cette charge HPV est un marqueur pronostique possible de haute qualité SIL

La fréquence élevée d’infection due aux types de HPV du papillomavirus humain associés à un risque élevé de cancer du col de l’utérus, «HPV à haut risque» chez les femmes séropositives, indique le besoin de nouveaux biomarqueurs cliniques capables d’identifier les sujets à risque pour le développement. des lésions cervicales Dans cette population immunodéprimée, l’absence de clairance virale et la persistance de l’infection augmentent le risque de progression vers la maladie , et des tests séquentiels pour l’ADN HPV ont été suggérés comme un outil cliniquement utile pour prédire un tel risque D’autres paramètres, tels que l’association entre la maladie cervicale et la charge virale à haut risque ou de multiples infections virales, sont étudiés pour augmenter le pouvoir prédictif des biomarqueurs virologiques. Jusqu’à présent, un faible accord a été atteint sur la valeur de ces paramètres. la charge virale a été associée à une clairance plus lente de l’infection et à une progression plus fréquente vers des lésions de grade supérieur [, -], et mu Dans la présente étude, nous avons étudié la valeur prédictive de ces paramètres chez les femmes séropositives en comparant les sujets observés longitudinalement subissant une résection chirurgicale des lésions cervicales de haut grade avec un contrôle. groupe de femmes ayant eu des résultats de colposcopie négatifs, mais résultats positifs de tests de dépistage du VPH à risque élevé

Sujets, matériaux et méthodes

Les patients étaient sélectionnés rétrospectivement parmi une cohorte de femmes observée dans une étude sur les caractéristiques de l’infection au VPH chez les femmes séropositives pour le VIH. Ce projet comprenait un suivi gynécologique systématique des patients par Papanicolaou Pap, une colposcopie avec biopsie, si des lésions ou des zones atypiques étaient visibles, et collecte des échantillons cervicaux pour la détection de l ‘ADN génomique HPV Les sujets ont été examinés à des intervalles de mois, et leur nombre de CD immunologiques et les paramètres virologiques charge virale et type d’ ADN HPV et charge ont été enregistrés Le consentement éclairé a été obtenu lors de la première visite. Utilisation scientifique des données cliniques et des prélèvements biologiques collectés pendant la période de suiviNous avons identifié des cas ayant reçu un diagnostic histologiquement confirmé de néoplasme intraépithélial cervical de haut grade CIN entre novembre et novembre et traités par des procédures d’excision électrochirurgicale en boucle. sujets avec HPV à haut risque mais negati Les résultats de la colposcopie ont été appariés en fonction de l’âge, du nombre de cellules CD, de la sévérité de la virémie VIH et du tableau thérapeutique anti-VIH. La sélection des femmes a été déterminée par la disponibilité des échantillons biologiques stockés.

Caractéristiques initiales des participants à l’étude avec des patients ou sans sujets témoins histologiquement confirmés lésions intraépithéliales squameuses de haut grade Échantillons SIL Un total d’échantillons ont été sélectionnés, parmi lesquels des femmes présentant des lésions cervicales de haut grade. chaque patient Le premier spécimen a été obtenu & lt; mois avant la chirurgie T; le second a été obtenu – des mois après la chirurgie T; et le troisième a été obtenu au cours du suivi à long terme, une durée médiane de jours intervalle interquartile [IQR], – jours après la ligne de base TA quatrième échantillon constitué de blocs de tissus inclus en paraffine – tranches obtenues du cône cervical pendant la résection chirurgicale T Résultats de l’analyse cytologique: les tests de Pap ont été évalués pour les lésions malpighiennes intraépithéliales malpighiennes de bas ou de haut grade sur la base de la version de le système Bethesda Le système de notation CIN a été utilisé pour le diagnostic histologique des lésions dysplasiques de bas grade, définies comme «CIN», et des lésions dysplasiques de haut grade, définies comme «CIN» et «CIN». Dans le rapport cytohistologique final, nous utilisé un schéma terminologique perfectionné pour augmenter la corrélation entre les systèmes de classification cytologique et histologique, en regroupant les SIL de faible qualité avec les CIN et les SIL de haute qualité avec CIN a Les résultats d’un frottis cervical anormal ont été identifiés par un cytologiste et examinés par un pathologiste, tous deux experts dans l’identification des lésions associées au VPH. Détection d’ADN HPV Des échantillons de brosse cervicale ont été recueillis dans un code d’échantillonneur cervical Digene – sans aucun fixateur 200 microlitres. la suspension cellulaire a subi une extraction d’ADN en utilisant le mini-kit d’ADN QIAmp Qiagen Des coupes de tissus inclus en paraffine ont été rincées dans du xylène, lavées deux fois dans de l’éthanol, digérées dans de la protéinase K et extraites par HP Hybrid Capture HC; Une évaluation semi – quantitative de ce paramètre a été réalisée en utilisant l ‘indice HC, qui représente le rapport, en unités de lumière relative, de l’ échantillon de l ‘étude à pg / mL d’ un échantillon de contrôle HPV – HPV – positif. Indice de HC de & lt;, une charge intermédiaire en tant qu’indice de -, et une charge élevée en tant qu’indice de typage de .HPV Les génotypes de HPV ont été déterminés par un essai d’hybridation en ligne-transfert inverse Innolipa HPV; Innogénétique, réalisée selon les instructions du fabricant Le terme «infection persistante» a été défini comme la présence des mêmes types viraux dans les échantillons obtenus au pinceau cervical T, au cône T et au pinceau cervical T ou dans les spécimens de cône et de brosse cervicale obtenus à T et T, respectivement Une infection de type spécifique a été définie comme «guérie» lorsqu’elle était présente dans l’échantillon cervical T et le spécimen de cône T, mais pas dans l’échantillon cervical T, ou lorsqu’il était présent dans le Toutes les autres combinaisons possibles d’infections virales spécifiques à un type, telles que celles détectées à T ou T seulement ou celles détectées à T et T, mais pas à T, ont été définies comme «aléatoires» et n’ont pas été considérées comme pertinentes pour la quantification de l’étudeHPV Pour déterminer le nombre de cellules d’entrée par test, chaque échantillon a été soumis à une quantification du gène β-globine domestique au moyen du kit de contrôle LightCycler. La charge de Roche HPV a ensuite été exprimée en nombre de copies s par nanogramme de β-globine La même région pour le génotypage de l’ensemble d’amorces SPF a été choisie pour la PCR en temps réel LightCycler A amorce inverse spécifique pour HPV de type HPV-; GTiGTATCiACCACAGTAACAAA a été ajouté aux amorces décrites par Weissenborn et al , pour équilibrer l’efficacité de l’amplification PCR. La charge virale a été déterminée avec le kit Sybr Green de départ chaud Roche selon les instructions du fabricant, avec une concentration finale en magnésium de Comme Sybr Green intercale l’ADN double brin, il est utile pour déterminer la charge virale totale dans des circonstances telles que celles-ci, où la variation de la séquence dans chaque souche rendrait difficile la quantification de la charge virale. Toutes les souches individuellement Une courbe standard a été construite en utilisant un fragment de HPV clone dans un vecteur plasmidique. Pour vérifier la spécificité de la réaction, le produit de PCR a subi une analyse de la courbe de fusion ° C pour s et ° C pour min. / s augmente en ° C pour mesurer la fluorescence dans un mode continuAnalyse statistique Le test de somme de rang Mann-Whitney pour les données non paramétriques a été utilisé pour comparer les moyennes indépendantes Les associations entre variables discrètes ont été testées par analyse or ou par le test exact de Fisher, car la valeur AP appropriée a été considérée comme statistiquement significative. La correction de Bonferroni a été pris en compte selon les besoins L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de SAS, version SAS

Résultats

Surveillance cytohistologique Le test T Pap pour les cas qui ont subi des procédures d’excision électrochirurgicale en boucle a révélé que les SIL de haute qualité et les SIL de bas grade Toutes les lésions ont été biopsiées, et l’examen histologique a détecté des lésions CIN ou CIN des échantillons, confirmant les résultats de tous. Frottis de Pap détectant les SIL de haut grade et révélant une sévérité accrue des SIL de bas grade. Neuf cas avaient des lésions qui ont rechuté à T, une médiane de jours IQR, – jours après T; avait un patient SIL de haut grade, et avait un patient SIL de bas grade,, -, et Au départ, l’atypie koilocytaire liée au VPH a été confirmée par les résultats des tests de Pap pour les contrôles; les lésions chez ces femmes n’ont pas été biopsiées à cause de résultats colposcopiques négatifs Tous les autres contrôles ont eu des résultats négatifs aux tests de Pap À T, les contrôles avaient une SIL faible et un condylome plat Tableau montrant les caractéristiques cytohistologiques et liées au VIH de la population étudiée Le tableau résume la comparaison des charges HPV dans les échantillons T entre les cas et les témoins Une différence significative a été observée entre les groupes en ce qui concerne les résultats PCR en temps réel et les indices HC P = et P =, respectivement

Table View largeTélécharger une diapositive Analyse comparative de la PCR longitudinale et de la capture hybride HC; Les résultats de Digene pour les patients atteints de lésions intra-épithéliales malpighiennes de haut grade et de sujets témoinsTable View largeTélécharger une diapositive Analyse comparée de la PCR longitudinale et de la capture hybride HC; Les résultats de Digene chez les patients atteints de lésions malpighiennes intraépithéliales de haut grade et chez les sujets témoins. La concentration de VPH diminue significativement entre T et T dans une analyse longitudinale des échantillons obtenus à T, T et T à partir des cas et des témoins. Résultats PCR et P = pour les indices HC, indiquant que l’élimination des lésions était associée à une diminution notable de la charge HPV Les changements longitudinaux représentatifs des indices HC et HPV détectés dans les échantillons de cône cervical à T sont montrés sur la figure

Figure Vue largeDownload slide Changements longitudinaux représentatifs dans Hybrid Capture HC; Les indices de Digene et les types de VPH du papillomavirus humain ont été détectés dans des échantillons cervicaux prélevés chez des patients subissant une ablation chirurgicale de lésions malpighiennes intraépithéliales de haut grade. Les patients A et C avaient un compte de cellules CD toujours & gt; cellules / μL Les patients B et D avaient un nombre de cellules CD qui était toujours & lt; cellules / μL Flèches, temps d’obtention des spécimens de cônes cervicaux; étoiles, temps au cours duquel SIL a récidivé, spécimen de brosse cervicale obtenu avant la chirurgie; T, spécimen de cône cervical obtenu lors d’une intervention chirurgicale; T, spécimen de brosse cervicale obtenu après l’achèvement de la chirurgie. Vue de la vue largeTéléchargement de diapositivesReprésentation des changements longitudinaux dans Hybrid Capture HC; Les indices de Digene et les types de VPH du papillomavirus humain ont été détectés dans des échantillons cervicaux prélevés chez des patients subissant une ablation chirurgicale de lésions malpighiennes intraépithéliales de haut grade. Les patients A et C avaient un compte de cellules CD toujours & gt; cellules / μL Les patients B et D avaient un nombre de cellules CD qui était toujours & lt; cellules / μL Flèches, temps d’obtention des spécimens de cônes cervicaux; étoiles, temps au cours duquel SIL a récidivé, spécimen de brosse cervicale obtenu avant la chirurgie; T, spécimen de cône cervical obtenu lors d’une intervention chirurgicale; T, prélèvement au pinceau cervical après l’intervention chirurgicaleHPV et résultats de l’analyse cytologique à T Dans les échantillons prélevés chez T provenant de cas et de témoins ayant une SIL faible, les charges HPV mesurées par PCR en temps réel étaient significativement plus élevées que les charges les témoins qui avaient un résultat de frottis négatif P = et P =, respectivement Une différence significative a également été révélée entre la charge de HPV dans les cas avec SIL de haute qualité et les contrôles avec une SIL de bas grade = En outre, l’indice HC était plus élevé dans les échantillons T obtenus à partir de cas ayant des SIL de bas grade, comparés aux témoins ayant des SIL de bas grade P = ou des résultats négatifs des tests Pap = P = charge HPV et résultats de l’analyse cytologique à T Nous avons également examiné et comparé les indices HC dans les cas et les contrôles à T, une durée médiane de jours IQR, – jours après T à T, seulement% des cas testés négatifs pour HPV à haut risque,% avaient un indice HC faible & lt ;, et% maintenu un indice HC élevé les derniers cas, ont eu des lésions qui ont rechuté avant l’observation cytologique subséquente; une tendance non significative vers un indice de HC plus élevé a été observée entre les cas qui ont présenté une lésion récidivante, par rapport aux cas qui ne l’ont pas été et avec les données de contrôle. non montré à T, contrôles% testés négatifs pour HPV à haut risque; % avait un indice HC bas & lt ;, et avait un indice HC élevé & gt; Deux des sujets ayant un indice de HC élevé ont développé un SIL de bas grade et un condylome plat, confirmant l’importance de la persistance virale et de la charge comme prédicteurs des lésions cervicales associées au VPHNombre et type d’isolats de VPH Le nombre médian de types de VPH , ceux associés à un risque faible ou élevé de lésions cervicales détectées dans l’échantillon cervico-brossé obtenu à T chez les cas et les témoins étaient IQR, – et IQR, -, respectivement P = non significatif, avec des infections multiples survenant en% de En outre, les types de HPV n’étaient pas significativement différents entre les groupes. Dans l’échantillon de cône cervical obtenu à partir de cas à T, une médiane des types de HPV IQR, – types ont été détectés, avec des infections multiples détectées en% de l’échantillon cervico-brachial obtenu à partir de cas à T, des infections multiples ont été détectées en%, avec une médiane des types viraux par sujet IQR, -, qui n’était pas statistiquement différente des valeurs T pour les cas et contrôles Les types de VPH à risque élevé détectés le plus fréquemment dans l’échantillon T étaient HPV- [%] dans les cas et les types [%] et [%] dans les contrôles. Il est surprenant que, parmi les cas, le type le plus fréquemment détecté dans les échantillons cônes était HPV- [%] de, qui a été combiné avec HPV- dans les cas, HPV HPV-in, et HPV- et HPV- dans des combinaisons aléatoires d’autres types, impliquant principalement HPV-, ont également été détectés parmi les cervicales Les échantillons de brosse obtenus à partir des cas de T, HPV et HPV étaient les types les plus fréquemment isolés. En examinant si la persistance virale est un facteur clé dans l’évolution des lésions cervicales, nous avons été confrontés à un problème très complexe. , avec un nombre variable des mêmes types de HPV détectés dans les échantillons de brosse cervicale obtenus chez les patients T, T et T et – ou dans les échantillons de cônes et de cervicales obtenus chez T et T, respectivement patients,,, et une infection à HPV à haut risque de type unique a été guérie chez les patients -,,, et bien que d’autres composants de l’infection multiple aient été détectés au hasard pendant la période d’observation

Figure View largeTélécharger slide Papillomavirus humain type HPV chez les patients ayant subi une résection chirurgicale de lésions malpighiennes intraépithéliales de haut grade Boîtes gris foncé, infections persistantes; boîtes gris clair, infections guéries T, échantillon de brosse cervicale obtenu avant la chirurgie; T, spécimen de cône cervical obtenu lors d’une intervention chirurgicale; T, échantillon de brosse cervicale obtenu après l’achèvement de la chirurgie. Voir en grandDownload slide Papillomavirus humain type HPV chez les patients qui ont subi une résection chirurgicale de lésions malpighiennes intraépithéliales de haut grade Boîtes gris foncé, infections persistantes; boîtes gris clair, infections guéries T, échantillon de brosse cervicale obtenu avant la chirurgie; T, spécimen de cône cervical obtenu lors d’une intervention chirurgicale; T, échantillon de brosse cervicale obtenu après l’achèvement de la chirurgie Neuf des cas développé une nouvelle lésion cervicale pendant le suivi Un patient de cas a connu un rechute de haute qualité SIL jours après T, et les patients,, -, et connu un rechute bas grade SIL une médiane de jours IQR, – jours après T; Dans le dernier cas,% avait une infection persistante. Dans le cas du patient, bien qu’une charge virale très élevée ait été détectée par PCR et HC dans l’échantillon obtenu à T, il n’a pas été possible de taper un HPV, probablement à cause de problèmes techniques ou de présence. d’un type viral qui n’était pas inclus dans notre système Des infections persistantes ont également été documentées dans% des cas qui n’ont pas connu de rechute La prévalence de l’infection persistante chez les femmes ayant rechuté n’était pas statistiquement différente de la prévalence parmi celles qui n’ont pas rechuté

Discussion

antification [,,,,] Si le cancer du col de l’utérus est considéré comme une maladie clonale, c’est-à-dire une maladie causée uniquement par un type oncogène, l’approche «type unique» serait la plus appropriée. et al et Huang et al , nous ne devrions pas exclure l’hypothèse que la maladie peut aussi être polyclonale et que l’activité réplicative simultanée de différents virus potentiellement oncogènes dans le même environnement pourrait contribuer au processus pathogénétique. Cette spéculation est particulièrement suggestive. la population des personnes infectées par le VIH et probablement des hôtes immunodéprimés en général, où la difficulté du système immunitaire à éliminer l’infection au VPH peut contribuer à la persistance de plusieurs types, car nos données confirment également qu’une médiane des types de VPH a été détectée dans les échantillons de cônes cervicaux , et / ou peut augmenter la capacité pathogène du type HPV par ailleurs associée à un risque intermédiaire de lésions cervicales. En outre, la possibilité Une revue relativement récente par Snijders et al a conclu que, bien que la plupart des études sur la charge HPV aient impliqué HPV-, il n’y a aucune raison a priori pour laquelle la relation entre la charge de Le VPH à haut risque et le risque accru de lésions dysplasiques de haut grade dépendent du type de VPH Nos données démontrent que chez les personnes infectées par le VIH, il existe une forte prévalence d’infections à HPV à haut risque multiples et persistantes dans une lésion spécifique. le seul type de VPH à haut risque responsable de la genèse des résultats pathologiques n’est pas tenable, bien qu’il serait d’une grande pertinence clinique de choisir un marqueur diagnostique général pouvant identifier les patients à risque accru de développer des lésions cervicales comme marqueur de laboratoire, la charge virale de type unique n’est pas abordable, et nos résultats, basés sur l’observation longitudinale d’un groupe de patients bien affirmer qu’un seul type d’analyse par PCR, bien équilibré, consensuel ou l’indice semi-quantitatif HC peut être utilisé pour détecter la présence d’une réplication virale active et un risque accru de développer des anomalies cellulaires. Plusieurs études suggèrent que l’utilisation d’une concentration virale accrue comme Le marqueur ne permet pas de distinguer les lésions de bas et de haut grade Cependant, dans une population à forte prévalence de VPH, ce paramètre permet la sélection de femmes présentant des lésions de tout niveau de sévérité, conduisant le clinicien à un suivi plus adapté procédures [,,,,,] Nous avons observé une fréquence plus élevée des principaux types HPV oncogènes HPV-, -, et – chez les femmes avec SIL de haute qualité, par rapport aux contrôles Cependant, la distribution, le nombre et les types de souches de VPH impliquées dans les cas d’infection cervicale ne sont pas significativement différents entre les groupes Une observation inattendue dans cette étude a été la très haute fréquence de HPV- dans les spécimens de cône cervical obtenus à partir de patients avec CIN [%] de grade élevé, souvent en association avec d’autres types de VPH à risque élevé, même si, comme chez la majorité de ces patients, ce type n’a pas été détecté dans l’échantillon cervico-cervical de référence Contaminations PCR possibles ont été exclus par l’élimination chimique des produits PCR du processus, en utilisant des contrôles négatifs, et par le fait que HPV- n’a pas été détecté dans des échantillons testés simultanément. De plus, n =, des tranches supplémentaires incluses dans la paraffine étaient disponibles rebond. La signification de cette observation nécessite une analyse supplémentaire Cependant, nous pouvons supposer qu’elle représente une infection latente ou à replication lente des cellules souches basales, qui ont une plus faible capacité à induire la différenciation cellulaire, mais peuvent être impliquées dans la étapes précoces du processus oncogène Les infections à HPV multiples qui se chevauchent dans le temps et se produisent simultanément dans différents sites de la région cervico-vaginale sont plus facilement détectable dans les strates épithéliales superficielles recueillies par le brossage cervical et peut être impliqué dans le processus oncogène En outre, l’observation met en évidence la nécessité de comprendre le rôle des multiples infections à HPV à haut risque comme facteurs synergiques possibles dans l’accélération du processus oncogène et la véritable signification du concept d’infection persistante , ouvrant une nouvelle discussion sur les interactions complexes des infections concomitantes au VPH dans la carcinogenèse L’infection par le VIH est un facteur de risque bien reconnu de persistance du VPH à risque élevé dans le col de l’utérus En outre, pendant l’ère HAART, où la fréquence de certaines tumeurs liées au VIH a diminué, l’incidence du carcinome invasif du col utérin ne montre aucune tendance à diminuer L’augmentation de l’espérance de vie des patients infectés par le VIH à un plus grand risque de cancer invasif du col utérin, soulignant la nécessité d’identifier des marqueurs virologiques supplémentaires pour prévenir les sonner

Remerciements

Soutien financier IV Progetto Nazionale di Ricerca sull’AIDS proposition D Conflit d’intérêt potentiel Tous les auteurs: aucun conflit